植物细胞器，包括线粒体和叶绿体，具有独立的基因组，编码着呼吸和光合等关键过程所必需的基因。可是针对植物细胞器中的基因进行编辑一直是植物遗传学和生物技术领域尚未解决的问题，主要是因为缺乏适用于靶向细胞器DNA的合适工具。

为了解决这一问题，本研究开发了一个名为金门克隆系统的方法，其中包括16个表达质粒，其中8个用于将蛋白质送入线粒体，另外8个用于将蛋白质送入叶绿体。

而且我们还设计了一个包含424个转录激活因子样效应子阵列质粒的系统，用于组装DddA 衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）质粒，并利用这些质粒成功实现了对线粒体和叶绿体中的点突变的编辑。

在生菜和油菜籽愈伤组织中，我们的DdCBEs能够以高达25％（线粒体）和38％（叶绿体）的频率诱导碱基编辑。

我们还通过将DdCBE mRNA送入生菜原生质体中，成功实现了对叶绿体中的无DNA碱基编辑，从而避免了由DdCBE质粒引起的脱靶突变。

通过在叶绿体16S rRNA基因中引入点突变，我们还成功地生成了对链霉素或大观霉素具有抗性的生菜愈伤组织和小植株，其编辑频率高达99％。

一、编辑植物细胞器基因组对于研究基因功能、提高作物产量和改善性状至关重要

1.1 编辑植物细胞器基因组具有重要意义

目前可编程基因组编辑工具如锌指核酸酶、TALE核酸酶、CRISPR系统和碱基编辑器已被广泛应用于植物遗传研究和作物改良。

可是这些工具无法直接编辑植物细胞器（线粒体和叶绿体）中的DNA序列，可能因为难以同时递送引导RNA和Cas9蛋白至细胞器，或在细胞器中同时表达这两种成分。

植物细胞器基因组编码了许多对光合作用和呼吸作用必不可少的基因，因此在细胞器中编辑这些基因对于研究基因功能、提高作物产量和改善性状非常重要。

最近的研究表明，无CRISPR的DdCBE工具能够在哺乳动物细胞的线粒体DNA中实现靶向C∙G到T∙A碱基替代。DdCBE由无毒的DddA tox分裂结构域、定制设计的TALE阵列和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI组成。

通过金门组装系统构建了靶向叶绿体或线粒体的DdCBE质粒，并在植物细胞器中表达。这种方法提供了一种快速方便的系统，可用于高效编辑植物细胞器基因组，通过识别特定长度的DNA序列进行碱基替代。所以通过使用DdCBE工具实现植物细胞器DNA的编辑，可以为研究基因功能和改良作物品质提供新的可能性。

1.2 使用无CRISPR的DdCBE工具实现细胞器DNA编辑

通常由催化缺陷的CRISPR相关蛋白9变体和核碱基脱氨酶蛋白组成。这些工具已被广泛用于植物遗传研究和作物改良，通过对基因组DNA序列进行操作。目前这些工具无法直接编辑植物细胞器（包括线粒体和叶绿体）中的DNA序列。

这是因为将引导RNA和Cas9蛋白同时递送到细胞器或同时在细胞器中表达这两种成分存在困难。

开发能够在细胞器中编辑这些基因的方法或工具对于研究其功能、提高作物产量和改善性状非常重要。

最近的研究表明，一种名为DdCBE的无CRISPR胞嘧啶碱基编辑器可以在哺乳动物细胞的线粒体DNA中实现对C∙G到T∙A的碱基替代。

DdCBE由细菌胞苷脱氨酶毒素（DddA tox）的无毒分裂结构域、定制设计的TALE阵列和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）组成。它以异二聚体的形式催化胞嘧啶脱氨作用，使C转变为T，在目标DNA中的两个TALE蛋白结合位点之间的间隔区域发挥作用。

研究人员首先开发了一种名为金门组装系统的方法，用于构建靶向叶绿体的DdCBE质粒或靶向线粒体的DdCBE质粒。

这些表达质粒包含叶绿体转运肽或线粒体靶向序列，TALE N-或C-末端结构域，以及split-DddA tox的融合蛋白一半和UGI。它们通过密码子优化，以在双子叶植物中实现表达，使用欧芹泛素启动子和pea3A终止子。通过在Eppendorf管中混合表达载体和六个TALE子阵列质粒，可以在单个克隆步骤中构建具有定制设计的TALE DNA结合阵列的DdCBE质粒。

共有424个（6×64三联+2×16双联+2×4单联）模块化TALE子阵列质粒可用于制作识别16-20个碱基对DNA序列的cp-DdCBE或mt-DdCBE，其中包括5'末端的保守T。因此，功能性的DdCBE异二聚体可以识别长度为32到40个碱基对的DNA序列。

图1：植物细胞器基地编辑的Golden Gate组装系统。

二、实验方法

2.1 用于在植物原生质体中表达的质粒的构建

DdCBE Golden Gate 目标载体是使用 Gibson 组件构建的。编码 TAL N 末端结构域、HA 标签、FLAG 标签、TAL C 末端结构域、split-DddA tox和 UGI 的序列经过密码子优化以在双子叶植物植物中表达，并通过 Integrated DNA Technology 合成。

编码来自AtinfA和 AtRbcS 的 CTP以及来自 ATPase delta 亚基和 ATPase gamma 亚基的 MTS 的序列从拟南芥cDNA中扩增。PcUbi 启动子和 pea3A 终止子用于替代骨架质粒中的哺乳动物 CMV 启动子，用于植物表达. 为了构建用于体外 DdCBE mRNA 转录的载体，将 T7 启动子盒克隆到 PcUbi 启动子和 DdCBE 编码区之间的 DdCBE Golden Gate 目的载体中。

TALE 阵列基因由单向金门组装克隆。表达 DdCBE 的质粒是通过使用 424 TALE 阵列质粒和目的载体对 Golden Gate 组装产物进行 BsaI 消化和 T4 DNA 连接而构建的。使用以下步骤进行单向 Golden Gate 克隆：20 个循环，每个循环 37°C 和 50°C 5 分钟，然后在 50°C 下最终孵育 15 分钟和 80°C 5 分钟。

2.2 原生质体分离和转染

生菜种子在 70% 乙醇中表面灭菌 30 秒，在 0.4% 次氯酸盐溶液中表面灭菌 15 分钟，并在蒸馏水中洗涤 3 次。生菜种子在添加 2% 蔗糖的 0.5× Murashige and Skoog 培养环境在 25 °C 光照 16 小时和黑暗 8 小时的条件下发芽。

油菜籽 种子在 70% 乙醇中表面消毒 3 分钟，在 1.0% 次氯酸盐溶液中表面消毒 30 分钟，然后用蒸馏水洗涤 3 次。油菜种子在添加 3% 蔗糖的 1× MS 培养基上于 23 °C 条件下 16 小时光照和 8 小时黑暗条件下发芽。

7 日龄生菜和 14 日龄油菜籽植物的子叶在孵育期间用酶溶液（1% 粘酶、0.5% 纤维素酶、0.5% 诺维酶、3 mM MES、9% 甘露醇和 CPW 盐，pH 5.8）消化在室温下在黑暗中摇动 (40 rpm) 3 小时。

用等体积的 W5 溶液（154 mM NaCl、125 mM CaCl 2、5 mM KCl、5 mM 葡萄糖和 1.5 mM MES，pH 5.6）洗涤原生质体-酶混合物，并在蔗糖梯度（ 21%），以 80 g离心 7 分钟。在聚乙二醇 (PEG) 介导的转染之前，将原生质体在 W5 溶液中于 4°C 孵育 1 小时。

用质粒（每个构建体 30 μg）或 mRNA 转染重悬于MMG 溶液（0.4 M 甘露醇、15 mM MgCl 2和 4 mM MES，pH 5.7）中的生菜原生质体 (5 × 10 5 ) 和油菜原生质体 (2 × 10 5 )（每个转录本 40 μg）通过 PEG（40%（w/v）PEG 4,000、0.2 M 甘露醇和 0.1 M CaCl 2）介导的转染并在室温下孵育 20 分钟。PEG-原生质体混合物用等体积的 W5 溶液洗涤 3 次，轻轻翻转并孵育 10 分钟。然后通过以 100 g摆动离心 5 分钟使原生质体沉淀。

三、结语

本论文综述了当前可编程基因组编辑工具在植物遗传研究和作物改良中的应用，并强调了目前这些工具尚不能直接编辑植物细胞器（包括线粒体和叶绿体）中的DNA序列的限制。

然而，最近的研究表明无CRISPR的DdCBE工具可以在哺乳动物细胞的线粒体DNA中实现靶向碱基替代，为在植物细胞器中实现高效碱基编辑提供了新的可能性。

该研究开发了一种快速便捷的金门组装系统，用于构建靶向叶绿体或线粒体的DdCBE质粒，并成功实现了在植物中的表达。通过利用定制设计的TALE DNA结合阵列和DdCBE的催化作用，可以识别和编辑细胞器DNA中特定的碱基序列，包括关键的光合作用和呼吸作用基因。

这项研究的成果对于研究植物细胞器功能、提高作物产量和改良性状具有重要意义。通过实现高效的细胞器碱基编辑，研究人员可以深入探索植物细胞器中的基因功能，并有望开发出更具适应性和抗性的作物品种。

尽管目前的工具还存在一些挑战和技术难题，如同时递送引导RNA和Cas9蛋白至细胞器的困难，但这项研究为解决这些问题提供了新的思路和方法。未来的研究可以进一步优化和改进细胞器基因组编辑工具，以实现更高效、精确和可控的编辑，并拓展其在植物遗传改良领域的应用。

参考文献

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Zhang, F.《使用锌指核酸酶在拟南芥中实现高频率的靶向突变》在《美国国家科学院院刊》所发表的107, 12028–12033 (2010)